Comment extraire la phycocyanine de la spiruline?
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Comment extraire la phycocyanine de la spiruline?

Nombre Parcourir:0     auteur:Gigi     publier Temps: 2021-10-25      origine:Propulsé

Extraction dephycocyaninede la spiruline

Principe de l'expérience

1. Méthode de congélation: congeler les cellules à basse température pour un certain période de temps, puis enlevez-les et décongelez-vous à la température ambiante. Répété congélation et décongélation pendant plusieurs fois, les cellules peuvent gonfler et se briser lors de la formation de particules de glace et augmenter la concentration de sel cytosolique restant.

2. Méthode de salage: les ions positifs et négatifs formés par le L'ionisation du sel dans la solution aqueuse peut attirer des molécules d'eau, ainsi que détruire le film éclaboussure de la protéine, neutraliser une partie de la charge, et provoquant que la protéine regroupe et précipiter et précipiter de la Solution. En raison de la différence de taille de différentes particules de protéines, la quantité de charge et le degré d'hydrophilie, quand un certain sel neutre est utilisé pour être salé, la concentration minimale de sel requise varie.

3. DEAE-CELLULOSE: Nom anglais DEAE-Cellulose, diéthylaminoéthyle Cellulose, capacité d'échange totale 0.9MEQ / G Groupe fonctionnel: diéthylaminoéthyle. Échangeur d'anions faiblement basique. Principe: contient certains groupes fonctionnels, qui peut être échangé des ions. La performance est plus douce que celle de General Ion Résines d'échange. Il convient à la séparation de l'actif biologiquement actif macromolécules et peut séparer les substances macromoléculaires avec des Propriétés.


Extraction de phycocyanine

extraction C-phycocyanine de la biomasse humide de la spiruline platensis

Étapes expérimentales

1. Extraction de phycocyanine

Prendre 10 g de poudre de spiruline, versez-la dans une bouteille en plastique, ajoutez 100 ml de extraire, sceller la bouche de la bouteille et congeler à basse température (-20) pour un certaine période de temps, puis enlevez-le et laissez-le fondre à la température ambiante, Puis placez-le à basse température (-20), ce gel répétimé et décongélation trois fois, les cellules peuvent gonfler et se briser tout en formant des particules de glace et augmenter la concentration de cytosalt restant. Phénomène expérimental: Avant décongélation: Solide vert foncé (légèrement violet) après décongélation: la solution obtenu par congélation et décongélation de la solution vert foncé a été centrifugée deux fois à 4000 tr / min pendant 10 minutes pour obtenir un surnageant bleu vif, qui était collecté dans un petit bécher et jeté la couche inférieure est vert foncé précipitation.


Procédé d'extraction de phycocyanine pour une utilisation à grande échelle

Précipitation de phycocyanine par la méthode de salage

1. Production de courbe de salage de phycocyane

Prenez six tubes de test numérotés 1 à 6, ajoutez 5 ml de l'extrait initial respectivement, ajoutez une solution saturée de sulfate d'ammonium (69,7 g de sulfate d'ammonium à Solution de 100 ml) 2, 3, 4, 5 ml dans le tube à essai 1-4, puis ajoutez de l'eau distillée 3. 2, 1, 0 ml, ajoutez 0,66 et 1,37 g de sulfate d'ammonium solide pour tester les tubes 5-6, Ajoutez ensuite 5 ml de solution saturée de sulfate d'ammonium, bien agiter pour dissoudre, mettre dans le réfrigérateur pendant plus d'une demi-heure, mettez-le dans une centrifugeuse à 4000RPM 10min, collectez le précipité et dissolvez le précipité avec 5 ml, 0.02mol / l pH6.5 tampon phosphate. Prenez la saturation du sulfate d'ammonium comme le abscisse et la concentration de la phycobiliproteine ​​comme l'ordonnée pour tracer la Courbe de salage de phycocyanine.


C = (A620-0.474A650) /5.34 (mg / ml)


A620 et A650 sont l'absorbance à 620 et 650 nm, respectivement ajustées à zéro avec tampon phosphate.


Purification de la phycobiliproteine

  1. Peser (NH4) poudre solide 2SO4, ajoutez lentement à un petit bécher plusieurs fois, et remuez tout en ajoutant pour faire la solution de solution de (NH4) 2SO4 REACH 20% (11,4%). Placez-le au réfrigérateur pendant une demi-heure, centrifuge à 4000 RPM pendant 10 min, après la sédimentation centrifuge, obtenez un bleu vif surnageant et jetez le précipité bleu. Ajouter du sulfate d'ammonium pour faire le (NH4) 2SO4 La concentration de la solution atteint 50% (31,3%, déduire la quantité de sulfate d'ammonium ajouté avant). Après centrifugation et sédimentation à une hauteur vitesse à 4000 tr / min pendant 10 min, un précipité bleu foncé est obtenu et le Le surnageant vert jaune est jeté. Ajouter plus de 15 ml d'eau distillée dissoudre le précipité résultant pour une utilisation ultérieure (la quantité d'eau est aussi Peu aussi possible possible, qui est propice à la dialyse).


2. Coupez un sac de dialyse d'environ 25 cm de long, mettez-le dans un bécher et faites bouillir 5 minutes (heure du temps que l'eau est bouillante), attachez une extrémité avec une mince Fil, pliez-le en deux et attachez-le avec un filetage mince. Verser le précédemment solution dissoute et précipitée dans le sac de chromatographie. Mettre dans eau distillée et changer le dialysat toutes les heures. Après la dialyse, mettez-le dans PEG-6000 Particules solides pour la concentration.


3. Prenez une colonne de chromatographie, nettoyez-la après la détection de fuites et réparez-la sur le support de fer avec deux pinces de fer. Vérifiez s'il est vertical de la avant et le côté, et ajustez-le s'il n'est pas vertical. Peser 20g Deee-cellulose-52 dans un bécher, gonflement avec une solution de NaCl de 0,5 m et 0,5 m NaOH pour 20 minutes, puis laver avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il soit neutre. Puis utiliser Solution de 0,5 MHCl pour gonfler pendant 20 minutes, puis laver avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il soit neutre. Enfin, Equilibrez avec du tampon phosphate de 0,02 m, Ph6.5 pendant la nuit. Incorporer la solution doucement et versez-la uniformément dans la colonne. Là devrait être un espace de 2 ~ 3 cm sur la surface de liquide dans la colonne, puis chaque temps la surface liquide se déplace vers la position d'origine d'origine, l'eau est ajouté à la hauteur correspondante, de sorte que l'eau distillée est toujours plus plus de 2cm supérieur à la charge.


4. Relâchez la mémoire tampon dans la colonne de chromatographie préparée et éteignez l'interrupteur de la colonne lorsque le niveau de liquide n'est que d'environ 1 cm supérieur à celui de la remplisseur. Utilisez un compte-gouttes à pointe en caoutchouc pour sucer l'extrait de phycocyanine brute dialysée, étendez-la dans la surface liquide de la colonne, laissez tomber l'extrait brut le long de la paroi du tube à une vitesse très lente au milieu de la surface liquide, et accélérer le gouttement après que le niveau de liquide augmente. Accélération. Quand le Le niveau de liquide n'est qu'en environ 2 cm de la bouche de colonne, allumez le commutateur complètement et continuer à goutter l'extrait brut.


5. Lorsque le niveau de liquide de l'extrait brut n'est que d'environ 1 cm supérieur à celui La charge de remplissage, ajoutez une solution tampon phosphate de 0,02 m, pH6.5 goutte à goutte pour rincer l'extrait brut restant. Ne l'ajoutez pas à la fois, mais ajoutez d'abord un petit montant pour rincer l'extrait brut restant propre (jusqu'à ce que la solution soit claire), puis ajouter une grande quantité. Enfin, ajoutez 0,5 m NaCl-0.02m, phosphate PH6.5 amortir.


6. Observez soigneusement. Lorsque la solution bleue est sortie, commencez Collectionner immédiatement, 2 ml un tube (collecte de 10 tubes au total). Après le Le tube à essai est collecté, la couleur de la solution dans le tube de test change: lumière → foncé → lumière Prenez la solution tampon phosphate comme contrôle vierge tube et utilisez un spectrophotomètre pour mesurer son A620nm et son A650NM.


7. Calculez la concentration de phycocyanine de chaque tube à base d'A620nm et A650nm.

Détermination: la concentration ou l'activité de chaque tube de solution collecté sera alors déterminé. Selon les résultats de la mesure, le la courbe d'élution peut être dessinée (à l'aide du nombre de tubes ou du volume d'élution comme abscisse et la concentration de chaque tube de la solution échantillon comme le ordonnée)